SN/T 5760.4-2024 进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法第4部分：肺炎克雷伯氏菌

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资料名称：	SN/T 5760.4-2024 进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法第4部分：肺炎克雷伯氏菌
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资料归类：	检验检疫
整理时间：	2025-01-23
软件简介：	中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5760.4—2024 进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR 法第4 部分：肺炎克雷伯氏菌 Droplet digital PCR method for detection of pathogens in cosmetics for import and export— Part 4: Klebsiella pneumoniae ICS 71.100.70 CCS Y 42 中华人民共和国海关总署发布 2024-12-16 发布2025-06- 01 实施 I 前言本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件为SN/T 5760—2024《进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR 法》的第4 部分。 SN/T 5760— 2024 已经发布了以下部分： ——第1 部分：大肠埃希氏菌； ——第2 部分：金黄色葡萄球菌； ——第3 部分：铜绿假单胞菌； ——第4 部分：肺炎克雷伯氏菌； ——第5 部分：洋葱伯克霍尔德菌； ——第6 部分：沙门氏菌； ——第7 部分：白色念珠菌； ——第8 部分：破伤风梭菌； ——第9 部分：柠檬酸杆菌； ——第10 部分：嗜麦芽窄食单胞菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：广州海关技术中心、广东省科学院微生物研究所、广东省科学院生物与医学工程研究所、广州国际旅行卫生保健中心、中国海关科学技术研究中心。本文件主要起草人：董洁、袁慕云、陈碧玲、冼钰茵、王永红、林雅慧、刘婧文、吴祖庆、陈梦琪、张玉莲、凌莉、綦佩妍、王艺凯、邱烨、刘鑫。 III 引言化妆品中病原菌可通过不同途径进入机体，对消费者的健康带来风险。SN/T 5760—2024《进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR 法》采用微滴式数字PCR 法，对化妆品中10 种代表性病原菌进行检测，旨在建立灵敏度高、抗干扰能力强的检测方法，以保护消费者健康，促进化妆品进出口贸易。SN/T 5760— 2024 由10 个部分组成： ——第1 部分：大肠埃希氏菌； ——第2 部分：金黄色葡萄球菌； ——第3 部分：铜绿假单胞菌； ——第4 部分：肺炎克雷伯氏菌； ——第5 部分：洋葱伯克霍尔德菌； ——第6 部分：沙门氏菌； ——第7 部分：白色念珠菌； ——第8 部分：破伤风梭菌； ——第9 部分：柠檬酸杆菌； ——第10 部分：嗜麦芽窄食单胞菌。 1 进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR 法第4 部分：肺炎克雷伯氏菌 1 范围本文件描述了进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌的微滴式数字PCR 检测方法。本文件适用于进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌的快速检测。本文件所能达到的检出限（LOD50）为 0.27 CFU/g（mL）~0.47 CFU/g（mL）。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T 2206.3 化妆品微生物检验方法第3 部分：肺炎克雷伯氏菌 SN/T 5075 化妆品微生物检验制样规范 3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语下列缩略语适用于本文件。 DNA ：脱氧核糖核酸（Deoxyribonuleic Acid） ddPCR ：微滴式数字PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction） PCR ：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） 5 方法原理针对肺炎克雷伯氏菌phoE 基因设计引物、探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA 及反应预混液混合，配成PCR 反应体系。将该数字PCR 体系分布到12 000 个~20 000 个微滴中，使大部分微滴中模板DNA 分子的数量为1 或0，然后进行PCR 扩增。探针5’端标记FAM 荧光基团，3’端标记BHQ1。利用数字PCR 系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA 的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴簇。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有肺炎克 2 雷伯氏菌。 6 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 6.1 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃。 6.2 冰箱：2 ℃ ~8 ℃、-20℃。 6.3 均质器或乳液分散机（转速1 000 r/min 以上）。 6.4 电子天平：感量0.1 g。 6.5 高速微量离心机（最大离心力不小于 10 000 g）。 6.6 涡旋振荡仪。 6.7 加热装置：95 ℃ ~100 ℃。 6.8 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.9 无菌均质袋或均质杯。 6.10 生物安全柜。 6.11 ddPCR 扩增仪及相关配套设备。 6.12 移液器及配套吸头：100 μL~1 000 μL、20 μL ~200 μL、10 μL ~100 μL、0.5 μL ~10 μL。 6.13 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL。 6.14 阳性对照：肺炎克雷伯氏菌 CICC 21519 或等效菌株或含目的片段的DNA。 7 材料和试剂 7.1 仅使用分析纯试剂和符合GB/T 6682 规定的一级水。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。 7.2 DNA 提取液：见附录A 中A.1。 7.3 大豆酪蛋白卵磷脂吐温80（SCDLP）液体培养基：见附录A 中A.2。 7.4 细菌基因组提取试剂盒。 7.5 生理盐水：见附录A 中A.3。 7.6 ddPCR 反应配套试剂。 7.7 肺炎克雷伯氏菌phoE 基因特异性序列片段参见附录B，引物探针如下： Primer-F ：5’-CTGGCGACCATGTACTCTG-3’ Primer-R ：5’-CCACCGCTTCAAAGTTCTG-3’ Probe-P ：5’-FAM -AAACCCGCAAGATGACCCCGAT- BHQ1-3’ 8 检验程序进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌ddPCR 检验程序见图1。 3 图1 进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌检验程序 9 实验操作步骤 9.1 样品前处理待测的样品应在室温下保存，不要温育、冷藏和冷冻样品。样品的制样处理参照SN/T 5075 的规定执行。 9.2 增菌培养吸取10 mL 1:10 样品稀释液接种到 90 mL SCDLP 增菌液中，置于36 ℃ ±1 ℃培养箱培养 18 h~24 h。 9.3 DNA 提取混匀增菌培养物，在其液面表层吸取1 mL，于 10 000 g~12 000 g 离心3 min，弃去上清液。必要时，用生理盐水清洗沉淀1 次~2 次。用1 mL 生理盐水混悬沉淀，于10 000 g~12 000 g 离心3 min，弃去上清液。在沉淀中加入 50 μL DNA 提取液振荡混匀，于95 ℃ ~100 ℃加热 10 min，室温冷却 2 min 后，于10 000 g~12 000 g 离心5 min，取上清液作为 DNA 模板。若不能及时分析DNA 模板可置于-20 ℃以下冷冻保存备用。注: 若采用商品化 DNA 提取试剂盒，按其操作说明制备 DNA 模板。 9.4 DNA 浓度和纯度测定样品DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260 nm 和280 nm 处的吸收值A260 和A280，按照公式（1）计算DNA 的浓度。 ρ=A260×N×50 ……………………………（1）式中： ρ—— DNA 浓度，单位为纳克每微升（ng /μL）； 4 A260—— 260 nm 处的吸光值； N —— 核酸稀释倍数。 A260/A280 在1.8 ~ 2.0 之间，DNA 浓度为0.01 ng/ μL~10 ng/ μL 时，适用 ddPCR 检测。 9.5 ddPCR 检测 9.5.1 对照和平行检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以肺炎克雷伯氏菌标准菌株DNA 或含目的片段的DNA 作为阳性对照，以非肺炎克雷伯氏菌标准菌株DNA 作为阴性对照，用等体积的一级水代替模板DNA 作为空白对照。每个待检样品提取的DNA 溶液进行3 个平行ddPCR 检测。 9.5.2 反应体系按照表1 配制反应体系。1）表1 ddPCR 反应体系试剂名称储备液浓度终浓度体积 μL 反应预混液2× 1× 10.0 Primer-F 10 μmol/L 0.90 μmol/L 1.8 Primer-R 10 μmol/L 0.90 μmol/L 1.8 Probe-P 10 μmol/L 0.45 μmol/L 0.9 DNA 模板— — 2.0 水— — 3.5 体系总体积— — 20.0 9.5.3 微滴生成将配制好的ddPCR 反应混合液，加入微滴生成装置加样孔中，按仪器操作说明生成微滴。 9.5.4 ddPCR 扩增将生成的微滴缓慢转移至96 孔板中，封膜后置于PCR 仪上，按以下参数进行PCR 扩增：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，40 个循环；98 ℃ 10 min，12 ℃ 10 min。升降温速度设置为 ≤ 2 ℃ /s。注：ddPCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。 9.5.5 荧光信号读取扩增反应结束后，将96 孔板放入ddPCR 检测仪中对每个微滴进行荧光检测，采用FAM 通道读取荧光信号。 1）非商业性声明：本文件给出的反应体系是使用伯乐设备完成的。给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。 5 10 结果分析与表述 10.1 阈值的设定根据空白对照的终点荧光值设定阈值限，阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。 10.2 质量控制 10.2.1 体系分隔产生的有效微滴的总数量满足作用ddPCR 仪器型号要求。 10.2.2 阴性对照和空白对照无荧光信号检出。 10.2.3 阳性对照有荧光信号检出且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开。 10.2.4 以上质控条件有一项不符合者，实验结果视为无效，查找原因后再次进行ddPCR 检测。 10.3 结果表述 10.3.1 待检样品所有微滴的荧光信号均低于阈值限，待测样品中不含有肺炎克雷伯氏菌，检测结果表述为“ 每克或毫升未检出肺炎克雷伯氏菌”。 10.3.2 待检样品3 个平行样品中至少1 个平行样品有荧光信号高于阈值限的阳性微滴，且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开，该样品结果为肺炎克雷伯氏菌初筛阳性，对样品的增菌液进一步按 SN/T 2206.3 中的操作步骤进行确认后报告结果。 11 生物安全和防污染措施为保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应按照 GB 19489 中的有关规定执行。防止交叉污染的措施应按照 GB/T 27403 中的规定执行。 6 附录 A （规范性）主要培养基和试剂 A.1 DNA 提取液 A.1.1 成分 Chelex-100 5.0 g 灭菌一级水 100 mL A.1.2 制法将 Chelex-100 颗粒加入灭菌一级水中混匀，2 ℃ ~8 ℃保存。 A.2 大豆酪蛋白卵磷脂吐温80（SCDLP）液体培养基 A.2.1 成分酪蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 卵磷脂 1.0 g 吐温80 7.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2 制法先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解，调 pH 值为 7.2~7.3，分装，每瓶90 mL，121 ℃高压灭菌 20 min。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80 充分混合，冷却至 25 ℃左右使用。注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。 A.3 生理盐水 A.3.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法将氯化钠在蒸馏水中溶解，121 ℃高压灭菌15 min。 7 附录 B （资料性）肺炎克雷伯氏菌特异性基因序列片段肺炎克雷伯菌phoE 基因序列（部分）及引物设计示意图（GenBank No. OR713899.1）见图 B.1。 CTCCGACCGTACCAACGATCAGAACCTGCTGGCCCGCGGCCAGGGTTCGAAAGCGGAAGCCTGGGCGAC CGGCCTGAAATATGACGCCAACAATATCTACCTGGCGACCATGTACTCTGAAACCCGCAAGATGACCCCG ATCAGCGGCGGCTTTGCCAACAAAGCGCAGAACTTTGAAGCGGTGGCGCAGTATCAGTTCGACTTCGGTC TGCGTCCGTCCCTCGGCTATGTGCTGTCGAAAGGGAAGGATATCGAAGGGGTGGGAAGCGAG 注：阴影部分分别为上下游引物序列，方框部分为探针序列。图 B.1 肺炎克雷伯菌phoE 基因序列（部分）及引物设计示意图
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